Magy Immunol/Hun Immunol 2004;3(4):35-9.

EREDETI KÖZLEMÉNYEK

Aktivált T-sejtek vizsgálata non-Hodgkin-lymphomás betegek esetében

dr. Váróczy László (levelező szerző), dr. Gergely Lajos, dr. Aleksza Magdolna, dr. Miltényi Zsófia, dr. Illés Árpád
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum,
Belgyógyászati Intézet, III. Sz. Belgyógyászati Klinika,
4004 Debrecen, Móricz Zs. krt. 22.
Telefon/fax: (52) 414-969, e-mail: varoczy@iiibel.dote.hu

Érkezett: 2004. május 13. Elfogadva: 2004. október 20.

A malignus lymphomák gyógyítása az utóbbi években-évtizedekben az onkohematológia egyik sikertörténetének számít. A hagyományosan bevált kemoterápiás szerek mellett egyre inkább előretörnek az úgynevezett biológiai terápiák is, s itt elsősorban a már széles körben alkalmazott tumorellenes monoklonális antitestek alkalmazására kell gondolnunk (például anti-CD20: rituximab, anti-CD52: alemtuzumab). A „hagyományos” citosztatikumok és a „modern” biológiai szerek kombinálásával javul a terápia eredményessége, és csökkennek a mellékhatások. Ideális esetben – az egyes betegek egyénre szabott prognózisának meghatározásával – megfelelő hatékonyságú és mellékhatásprofilú, „rizikóadaptált” kezelést lehetne alkalmazni.

A non-Hodgkin-lymphomás betegek prognózisáról a Nemzetközi Prognosztikai Index (IPI) meghatározása adhat többletinformációt. Ennek során öt, független rizikófaktort vesznek figyelembe, úgymint a kor, az Ann Arbor-féle betegségstádium, az extranodalis érintettség, a klinikai állapot és az LDH szérumszintje¹. Ez a skála ugyanakkor semmilyen közvetlen információval nem szolgál a betegek immunológiai állapotáról, tumorellenes immunvédelmi mechanizmusairól. Közismert és már-már közhelyszerű, hogy a különféle immundeficientiákkal sokkal gyakrabban társulnak malignus kórképek, ennek legismertebb példái éppen az AIDS-es betegek vagy a szervtranszplantáción átesettek kifejlődő lymphomái. Hogy az immunológiailag intakt szervezetben mégis miért fejlődhetnek ki és szaporodhatnak el malignus sejtklónok, az a mai napig is csupán találgatások, elméletek tárgya².

A malignus kórképekben, így a lymphomákban szenvedő betegek prognózisa szempontjából alapvetően fontos, hogy immunrendszerük hogyan képes felismerni a kóros sejteket, tud-e védekezni ellenük, és milyen mértékben képes elpusztítani vagy eliminálni azokat. A tumorellenes védekező mechanizmusok közül talán a legjelentősebb a T-sejtes immunválasz. Napjainkban lehetőség van már arra, hogy laboratóriumi módszerekkel meghatározzuk, a daganatos beteg vérében milyen arányban vannak jelen az antitumor-immunválaszban részt vevő aktivált T-sejtek³. Izgalmas volna ugyanakkor azt megtudni, mennyire hatékonyak a non-Hodgkin-lymphomás betegek tumorellenes immunvédelmi mechanizmusai, és hogyan változik mindez a kemoterápiás kezelés hatására. Elképzelésünk szerint erre egyfajta lehetőséget adnának az aktivált T-sejtekkel kapcsolatos mérések. Vizsgálataink során arra kerestünk választ, van-e különbség a perifériás vérben aktivált T-sejtek arányát tekintve az egészséges és a lymphomás populáció között, hogyan hat a kezelés az aktivált T-sejtek számára, és van-e összefüggés ezen arány és a betegek gyógyíthatósága, valamint prognózisa között.

Betegek és módszerek

Betegek

A Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, III. Sz. Belgyógyászati Klinika hematológiai részlegén 1999 és 2002 között non-Hodgkin-lymphoma miatt kezelt betegek közül 43 főt vontunk be a vizsgálatba (20 nő, 23 férfi, átlagéletkoruk 52,4 év). A szövettani típusok szerinti megoszlásukat az 1. táblázatban tüntettük fel. A betegek valamennyien a hazai és a nemzetközi standardot követő polikemoterápiás kezelésben részesültek, az alábbi kombinációk szerint: cyclophosphamid, vincristin, methylprednisolon (CVP protokoll), illetve a fentiek kiegészítve adriamycinnel (CHOP), valamint nagy rizikójú beteg esetén etoposidot, cytarabint, bleomycint és methotrexatot is tartalmazó protokoll (ProMACE-CytaBOM). Általában hat, maximum kilenc ciklus kemoterápiás kezelést alkalmaztunk, amelynek hatására a lymphomások remisszióba kerültek, ez alatt kifejezett malignitású non-Hodgkin-lymphoma esetén komplett remissziót, mérsékelt malignitás esetén jó életminőséget biztosító parciális remissziót kell érteni. A tanulmányból kizártuk a primeren kemorezisztens, a fenti konvencionális terápiákra nem megfelelően reagáló betegeket, valamint a leukaemiás vérképűeket. Nem vettük be a vizsgálatba a kezelés időszakában fertőzéses megbetegedésben szenvedőket sem. Kontrollcsoportként hasonló kor- és nembeli eloszlású 52 egészséges egyént vizsgáltunk. A betegeket végül két csoportra osztottuk annak megfelelően, hogy a kemoterápia befejezése utáni egy éven belül progrediált-e a betegségük vagy pedig tartósan remiszszióban maradtak.

1. táblázat. A vizsgálatban részt vevő non-Hodgkin-lymphomás betegek megoszlása szövettani altípusaik szerint (WHO-klasszifikáció, 2000).

B-sejtes (n=35) T-sejtes (n=8) Kifejezett malignitású diffúz nagysejtes:   perifériás 2   – anaplasticus 8 anaplasiás nagysejtes 6   – immunoblastos 7       – centroblastos 2       primer mediastinalis 2     Indolens kis lymphocytás 10       tüdő BALT 3       tonsilla MALT 1       follicularis I. grad 1     BALT: bronchialis mucosával kapcsolatos lymphoid szövet, grad.: malignitási fokozatú (grádusú), MALT: mucosaasszociált lymphoid szövet

Az aktivált T-sejtek analízise

A vérmintákat közvetlenül a kezelés megkezdése előtt, annak félidejében – a harmadik ciklus kemoterápia alkalmazása után –, illetve az utolsó kezelés után két hónappal vettük le. A heparinnal alvadásgátolt teljes vérmintákból 100 µl-t sötétben és szobahőmérsékleten inkubáltunk 30 percig fluoreszcens festékkel konjugáltatott CD3, CD69, valamint HLA-DR molekula ellen termelt ellenanyagokkal (Sigma, St. Louis, Montana, USA). A vörösvérsejtek lizálása után a fehérvérsejteket paraformaldehiddel fixáltuk. A kiértékelés EPICS XL-4 (Coulter, Hialeah, Florida, USA), valamint Becton Dickinson FACS Calibur (Mountain View, California, USA) áramlási citométeren történt, ahol a lymphocytákat nagyság és granuláltság alapján választottuk el a monocytáktól és a granulocytáktól. Ötezer lymphocyta megszámolása után adtuk meg a pozitív jelet adó sejtek százalékos arányát⁴. A statisztikai elemzések során a c²-próbát használtuk és a p<0,05 valószínűségi szintet tekintettük szignifikánsnak.

Eredmények

Elsőként az egészséges kontrollpopulációval hasonlítottuk össze a lymphomás betegeket. Azt találtuk, hogy közvetlenül a kezelés előtt a non-Hodgkin-lymphomás betegek vérében szignifikánsan magasabb az aktivált CD3+/HLA-DR+ T-sejtek aránya, mint az egészségesekében. A CD3+/CD69+ lym-phocyták esetén szignifikáns eltérést nem találtunk (1. ábra). A következőkben az aktivált T-sejtek ke- zelés előtti és a kezelés közbeni arányát hasonlítot- tuk össze. Ezúttal is csak a CD3+/HLA-DR+ sejtek aránya emelkedett szignifikánsan. A kezelés előtti és a kezelést követő, remisszióban mért aktivált T-sejtek aránya nem különbözött szignifikánsan egymástól (2. ábra).

1. ábra. A kezelés előtti aktivált T-sejtek arányának összehasonlítása az egészséges kontrollpopulációéval.

NS: nem szignifikáns

2. ábra. Az aktivált T-sejtek arányának összehasonlítása kemoterápiás kezelés előtt, közben és után.

NS: nem szignifikáns

A terápia utáni egyéves követés közben a betegeknek csaknem fele, 22 fő maradt remisszióban, a többi 21 esetén a lymphoma progrediált. Ezen két csoport kezelés utáni CD3+/HLA-DR+ sejtarányait tekintve jelentősen szignifikáns eltérést találtunk: a rosszabb prognózisú csoport vérmintáiban jóval több volt az aktivált T-sejt. A CD3+/CD69+ sejtek esetén ezúttal sem sikerült ilyen összefüggést kimutatnunk (3. ábra).

3. ábra. Az aktivált T-sejtek aránya kezelés után tartósan remisszióban levő, illetve egy éven belül visszaesett betegeknél.

NS: nem szignifikáns

Megbeszélés

Vizsgálataink eredményeivel kimutattuk, hogy a kezeletlen non-Hodgkin-lymphomás betegek vérében szignifikánsan nagyobb a CD3+/HLA-DR+ sejtek aránya az egészséges kontrollpopulációéhoz viszonyítva, illetve ez az arány a kezelés során szignifikánsan nő, majd a kemoterápia befejeztével lecsökken. A CD3+/ CD69+ sejtek aránya esetén szignifikáns eltérése- ket nem regisztráltunk. Összehasonlítottuk a CD3+/ HLA-DR+ sejtek arányát a kezelést követő egy éven belül remisszióban maradt és a visszaesett betegek között, és azt találtuk, hogy a progressziót mutató csoportban szignifikánsan magasabb volt az aktivált lymphocyták száma.

A T-sejtek aktivációjának, blastos transzformációjának két típusa ismert. Az úgynevezett mitogének (mint például a lektinek) a T-sejt-receptor (TCR) és a CD3 molekula komplexéhez kötődnek, kiváltva így a T-lymphocyták polyclonalis aktivációját, amelynek során a sejtek a sejtciklus nyugvó G0 fázisából a G1 fázisba lépnek, s ezt csakhamar osztódás követi. A specifikus T-sejt-aktiváció antigén hatására következik be, és szükséges hozzá az antigénprezentáló sejtek közreműködése. Intenzív fehérje- és nukleinsav-szintézis következik be, és a kis nyugvó sejtek lymphoblastokká alakulnak át. Sejtaktiváció esetén a lymphocyták számos antigént expresszálnak a felszínükön, a legismertebbek ezek közül a CD25, a CD71, a CD38, valamint az általunk vizsgált két marker: a CD69 és a HLA-DR^5–8. A CD69 a C típusú lektinek közé tartozik, szerkezetileg két diszulfidhíddal összekötött homodimerből áll^{9, 10}. In vitro kísérletek tanúsága szerint korai aktivációs markernek tekintendő, mitogénnel történő stimulációt követő három órán belül a lymphocyták 15%-ának felszínén már jelen van, az expresszió csúcspontja a hatodik napon van⁵. A HLA-DR az MHC II. családba tartozó hisztokompatibilitási antigén, négy doménből (a₁, a₂, b₁, b₂) épül fel¹¹. Késői aktivációs marker, az expresszió csúcsa a mitogénnel való stimuláció utáni nyolcadik napra esik, de ezt követően is viszonylag magas marad a HLA-DR+ T-sejtek aránya⁵. Mindkét antigén jelenléte összefügg az életkorral is: az idősebbek vérében általában alacsonyabb a CD3+/HLA-DR+ és a CD3+/CD69+ lymphocytaarány, mint a fiataloknál¹². Az, hogy vizsgálataink során a CD69+ sejtek száma nem változott szignifikánsan a lymphomás betegek vérében, talán épp a marker korai jellegének és az expresszió viszonylag gyors lecsengésének köszönhető. Az aktivált T-sejtek arányát jelentősen befolyásolják a szervezetet megtámadó kórokozók, nem véletlen, hogy a kezelés időszakában a fertőzéses kórképben szenvedő betegeket kizártuk a vizsgálatból.

A kezeletlen betegek vérmintáiban szignifikánsan magasabb volt a CD3+ és a HLA-DR+ sejtek aránya, mint az egészséges kontrollpopuláció esetén, ami esetleg azzal magyarázható, hogy az immunrendszer észleli a daganatsejteket és próbál védekezni ellenük. Kemoterápia után nagy számban pusztulnak el a malignus (és más, gyorsan osztódó) sejtek, így számos korábban rejtett, intracellulárisan elhelyezkedő antigén válhat az immunrendszer számára megközelíthetővé. Azt is mondhatnánk, hogy a citosztatikus kezelés közvetve stimulálja az immunválasz bizonyos effektormechanizmusait, így az aktivált T-sejtek működését is. A CD3+ és a HLA-DR+ sejtek arányának 2. ábrán bemutatott emelkedése talán ezzel a jelenséggel magyarázható. Azt természetesen nem állítjuk, hogy a kemoterápia sui generis immunstimuláló hatású, hiszen a citosztatikumok csaknem mindegyike jelentős csontvelő-depletiót okoz, hanem finom, de a tumorellenes védekezés szempontjából mégis fontos egyensúly-eltolódások következhetnek be az effektormechanizmusok működésében^13–16.

A legizgalmasabb megfigyelésünk mégis talán a legutolsó, a 3. ábrán feltüntetett szignifikáns eltérés. A kezelést követő vérvétel során mindenkinél feltételeztük, hogy remisszióban van (komplett vagy jó parciális remisszióban), de mint később kiderült, a betegek csaknem fele (21 fő) egy éven belül visszaesett. Ezen csoportban a HLA-DR+-aktivált T-sejtek aránya szignifikánsan nagyobb volt, s ez az immunrendszer „készenléti” állapotára utalt. Valószínűsíthető, hogy a betegek szervezetében a terápiát követően is maradtak még daganatsejtek, amelyek osztódásukkal egy éven belül kimutatható, relapsust jelző lymphomaszövetet hoztak létre. Kezdetben ez a minimális tumormennyiség a hagyományos stádiummeghatározó (staging) vizsgálat során alkalmazott fizikális és képalkotó vizsgálatokkal nem volt kimutatható, egyedül az aktivált T-sejtek nagy aránya utalhatott a jelenlétére. Nagyobb esetszámmal végzett vizsgálatok, valamint hosszabb ideig tartó követés fog majd választ adni arra, hogy az aktivált T-sejtek vizsgálata a későbbiekben alkalmas lesz-e a lymphomás betegek immunvédekezésének, prognózisának meghatározására, valamint megfelelő paraméter-e a minimális residualis betegség előrejelzésére.

Irodalom

1. Vose JM, Chiu BCH, Cheson BD, Dancey J, Wright J. Update on epidemiology and therapeutics for non-Hodgkin’s lymphoma. Hematology 2000;1:241-62.
2. Penn I. Tumours of the immunocompromised patient. Ann Rev Med 1988;39:63-73.
3. Tsuchiya T, Ohshima K, Karube K, Yamaguchi T, Suefuji H, Hamasaki M, t al. Th1, Th2, and activated T-cell marker and clinical prognosis in peripheral T-cell lymphoma, unspecified: comparison with AILD, ALCL, lymphoblastic lymphoma and ATLL. Blood 2004;103:236-41.
4. Aleksza M, Irinyi B, Lukács A, Antal-Szalmás P, Hunyadi J, Szegedi A. Increased frequency of intracellular interleukin (IL)-13 and IL-10, but not IL-4, expressing CD4+ and CD8+ peripheral T-cells of patients with atopic dermatitis. Br J Dermatol 2002;147:1135-41.
5. Caruso A, Licenziati S, Corulli M, Canaris AD, De Francesco MA, Fiorentini S, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T-cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry 1997;27:71-6.
6. Cebrian M, Yague E, Rincon M, Lopez-Botet M, Landazurl MO, Sanchez-Madrid E. Triggering of T-cell proliferation through AIM, an activation inducer molecule expressed on activated human lymphocytes. J Exp Med 1988;168:1621-37.
7. Corradin G, Etlinger HM, Chiller JM. Lymphocyte specific T-cell dependent proliferative response with lymph node cells from primed mice. J Immunol 1977;119:1048-53.
8. Nakamura S, Sung SSJ, Bjorndahl JM, Fu SM. Human T-cell activation IV. T-cell activation and proliferation via the early activation antigen EA-1. J Exp Med 1989;169:677-89.
9. Walsh GM, Williamson ML, Symon FA, Willars GB, Wardlaw AJ. Ligation of CD69 induces apoptosis and cell death in human eosinophils cultured with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood 1996;87:2815-21.
10. Simms PE, Ellis TM. Utility of flow cytometric detection of CD69 expression as a rapid method for determining poly- and oligoclonal lymphocyte activation. Clin Diagn Lab Immunol 1996;3:301-4.
11. Trowsdale J. Molecular genetics of HLA class I and class II regions. In: Browning M, McMichael AJ (eds.). HLA and MHC: genes, molecules and function. Oxford: Bios Scientific; 1996. pp.23-38.
12. Bisset LR, Lung TL, Kaelin M, Ludwig E, Dubs RW. Reference values for peripheral blood lymphocyte phenotypes applicable to the healthy adult population in Switzerland. Eur J Haematol 2004;72:203-12.
13. Muris JJF, Meijer CJLM, Cillessen SAGM, Vos W, Kummer JA, Bladergroen BA, et al. Prognostic significance of activated cytotoxic T-lymphocytes in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Leukemia 2004;18:589-96.
14. Gergely L, Aleksza M, Váróczy L, Ponyi A, Sipka S, Illés Á, Szegedi G. Intracellular IL-4/IFN-g producing peripheral T lymphocyte subsets in B-cell non-Hodgkin’s lymphoma patients. Eur J Haematol 2004;72:336-41.
15. Ansell SM, Stenson M, Habermann TM, Felinek DF, Witzig TE. CD4+ T-cell immune response to large B-cell non-Hodgkin’s lymphoma predicts patient outcome. J Clin Oncol 2001;19:720-6.
16. Bosshart H. T-helper cell activation in B-cell lymphomas. J Clin Oncol 2002;20:2904-13.

non-Hodgkin-lymphoma, activated T-cell, CD3+, HLA-DR+, CD69+, flow cytometry